酶是生物催化剂，有高选择性、反应条件温和、无污染等优点，在食品加工、医药、精细化工等行业应用广泛。但天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，反应后混入产品且纯化难，限制了其在工业中的广泛应用。此外，酶的分离、提纯及一次性使用增加了其作为催化剂的成本。于是，固定化酶的概念与技术应运而生并发展，成为酶工程研究重点。

酶固定化是用固体材料将酶限制在一定区域，使其能继续催化反应，还可回收、重复使用的技术，按酶的性质与用途，可分为吸附法、共价结合法、交联法、包埋法四种。

1、吸附法

吸附法是通过离子键、物理吸附等将酶固定在多糖类（如纤维素、琼脂糖）或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的方法。

其特点是工艺简便、条件温和，载体选择广，包括天然或合成的无机、有机高分子材料。吸附过程可同时实现酶的纯化和固定化，酶失活后可重新活化，载体可再生。国内有许多相关研究：
·朱俊晨等以多孔聚酯为载体固定黑曲霉菌丝体细胞，在特定条件下，菌丝生长和产糖化酶效果优于其他方法。
· Mojovic L.等将脂肪酶吸附在大孔共聚物载体上，在最优条件下有一定的吸附量和固定效率，该固定酶在水解椰子油时有一定的酶活力且重复使用多次后仍保留部分活性。
·KAMATA等在恒温恒时条件下将胰蛋白酶和a - 淀粉酶固定在珠状糖基蛋白上，所得固定化酶生命周期长。
·彭立凤等以CaCO3粉末为载体固定脂肪酶，该固定酶易回收且重复使用多次后仍保留一定酶活力，可用于催化反应且减少催化剂消耗。
·胡志国等合成嵌段共聚物，用电化学吸附法固定葡萄糖氧化酶制成电极，该电极有酶催化剂反应动力学特征。
·辛嘉英等根据脂肪酶同工酶结构差别，将其选择性固定在不同疏水性载体上，实现同工酶分离纯化和固定化。

但吸附法也有不足，如酶量选择靠经验，操作条件因酶和载体而异，酶与载体结合力不强易导致活性丧失和污染产物等，限制了其应用。为提高适用性，部分科研人员将吸附法与其他方法联用：
·岳振峰等以粉末状壳聚糖为载体，先吸附后交联固定α - 葡萄糖氧化酶，效果较好，酸碱和热稳定性好。
·曾鸣等在固定菊粉酶水解菊芋提取液制备果糖的研究中，采用吸附和共价结合的方法对内切菊粉酶和外切菊粉酶进行固定，取得了较好的果糖分离效果。

2、交联法

交联法是利用多功能试剂使酶蛋白交联，让酶分子与多功能试剂形成共价键，形成三向交联网架结构，其中既有酶分子间交联，也有分子内交联。

根据条件和添加材料不同，可产生不同物理性质的固定化酶。常用交联试剂有戊二醛、双重氮联苯胺 - 2,2'-二磺酸、1,5 - 二氟 - 2,4 - 二硝基苯、己二酰亚胺酸二甲酯等。例如用戊二醛作交联剂，将由乳酸制得的B - 乳糖苷酶固定在石墨表面，当石墨活性区域为17/100 - 25/100，固载量分别为1.8U/cm²和1.1U/cm²时，活性随酶固载量增加而增加，固定酶的Km值约为游离酶的5倍，用5%浓度的该固定酶水解乳糖，在37℃下反应3.5h以上，乳糖水解率接近70%，且该固定酶贮存稳定性和可操作性良好。

不过交联剂价格高，交联法很少单独使用，科研人员一般将其作为其他固定化方法的辅助手段来获得更好的固定效果。

3、共价结合法

共价结合法是通过酶蛋白分子上的功能团与固相支持物表面的反应基团形成化学共价键来固定酶。这种方法因酶与载体连接牢固、稳定性好和可重复使用，成为目前研究活跃的酶固定化方法。

常用载体——天然高分子：如纤维素、琼脂糖、淀粉、葡萄糖凝胶、胶原及衍生物等；合成高聚物：如尼龙、多聚氨基酸、乙烯 - 顺丁烯二酸酐共聚物等；无机支持物：如多孔玻璃、金属氧化物等。

应用案例——Wang SL： 将绿脓杆菌制备的壳多糖酶用共价结合法固定在羟丙甲基纤维素 - 乙酸 - 琥珀酸盐上。 该载体在不同pH值下溶解性不同，用粗制酶溶液固定有效率达99%。固定酶的激活能量降低，最适pH值为8，温度50℃，半衰期从9天提高到13天，重复使用10次后酶活力保持70%；AM Dessouki：将支链淀粉酶用共价结合法分别固定在环氧氯丙烷活化的琼脂糖和环氧氯丙烷活化的三氯三嗪 - 酪蛋白上，并合成共聚物丙烯酸盐 - 丙烯酸。 使用10次仅有约20%的损失，且固定酶对射线有高抵抗能力；ZAITA： 将黑曲霉制得的胞外内切菊粉酶共价固定在溴乙酰纤维素（BAC）、纤维素碳酸盐（CC）和溴化氰活化的琼脂糖（CAS）上。通过金属离子激发提高固定酶抵抗失活能力，不同载体固定的酶在温度、环境稳定性和Km值上有不同表现；K.H Jang：将Zymononas流动果聚糖蔗糖酶用离子结合法固定在羟（基）磷灰石表面，固定最适条件为pH值6.0，时间4h，固载量20U/g基体，用于洗涤剂时生物活性近似天然酶。

其方法缺点与联用——1. 共价结合法载体的活化或固定化操作复杂，要严格控制条件才能保证固定化酶活力高，受蛋白质连接基团和载体性质影响。2. 常与交联法联用，如安小宁等用壳聚糖包埋磁粉经戊二醛修饰、环氧氯丙烷交联制得微粒，再共价结合卵清粘蛋白得到磁性亲和吸附剂用于胰蛋白酶亲和纯化；郑连英用天然高分子聚合物几丁质作载体，戊二醛为交联剂固定纤维素酶用于降解壳聚糖；黄家贤等合成大孔型交联高分子酶载体，其中共价键结合酶不易脱落，可用于排除多肽类毒素。

4、包埋法

这是一种酶固定化方法，无需化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，反应条件温和且基本不改变酶结构。其原理是将单体与酶溶液混合后，通过引发剂聚合反应，把酶固定在载体材料网格中。固定化过程中，保护剂和稳定剂不影响酶的包埋产率，该方法适用于大多数酶、粗酶制剂和完整微生物细胞。

包埋法又分为两种：

凝胶包埋法：把酶分子包在高聚物格子中，可将块状聚合形成的凝胶切成小块，或直接包埋在珠状聚合物中，后者能使固定化酶机械强度提高 10 倍，减少酶的脱落。

微囊化法：将酶溶液或悬浮液包裹在膜内，膜能让酶处于类似细胞内的环境，防止酶脱落和直接接触微囊外环境，小分子底物可快速通过膜与酶反应，产物也能扩散出来。

这种包埋法能包埋大量酶，在医学上有很大应用潜力，受到越来越多关注。

目前，酶固定化技术在食品工业、精细化学品工业、医药（尤其是手性化合物领域）等行业应用广泛，在废水处理方面也有一定进展。

利用酶技术生产化工产品，条件温和且无 “三废” 产生。随着人们环保意识增强，酶的应用更受关注。充分运用天然高分子载体并对其改性，或借助超临界技术、纳米技术、膜技术等固定酶，会成为研究热点。

此外，开发新型、高效的固定化酶反应器以提高转化率和生产能力，是未来研究重点。各行业中固定化酶的应用研究也将推动酶固定化技术不断发展。