01
控制区域选择性化学
低聚糖的结构使其合成比其他主要类生物分子（寡核苷酸和寡肽）的合成更复杂。聚糖合成的基本挑战是需要在许多其他羟基存在的情况下修饰一个特定的羟基，以及在糖苷键形成过程中控制立体化学结果。通常，聚糖合成的特征是操纵各种保护基团，即掩盖羟基并防止其与其他化学试剂发生反应。选择性地从聚糖结构中添加和去除羟基保护基团，从而允许对暴露的羟基进行化学改变。在典型的聚糖合成方案中，一个羟基的选择性暴露允许另一个糖单元的区域选择性添加。这种类型的合成方案通常用于生成O-和N-连接的聚糖以及蛋白聚糖和鞘糖脂。
保护基团的选择和保护基团的组装顺序对合成路线的成功至关重要。最常见的保护基团包括通过许多合成步骤保持原位的苄基醚（永久保护基团）或在合成的中间步骤中去除的碳酸盐和酯（临时保护基团）。
控制立体化学
糖苷键通常通过糖基化试剂（糖基供体）来形成与亲核试剂反应的亲电子物质，例如，存在于糖基化受体上的羟基。其他可能的受体包括糖肽中的丝氨酸/苏氨酸，或鞘糖脂类的鞘氨醇。糖基化反应导致形成α-或β-糖苷键。聚糖合成中的一个主要挑战是糖苷键的立体选择性形成（图1A）。有多种方法可用于立体选择性地产生糖苷键。这些反应的产率和立体化学结果取决于糖基化试剂（糖基供体）的空间和电子性质、亲核试剂的性质和反应条件。控制异头中心立体化学的一种常见方法是在C2羟基或C2氨基上使用某些保护基团，如酯类或酰胺类/氨基甲酸酯（图1B）。这些“参与的相邻”保护基团可以在糖基化反应过程中形成环氧鎓离子中间体，保护分子的一个面，导致只形成“反式”-糖苷键（即异头取代基和C2基团位于环的相对侧，如β-葡萄糖苷）。相反的异头立体化学，称为“顺式”-糖苷键，具有更高的选择性，更难构建。虽然在反式糖苷键的合成过程中保护基团的参与不如立体选择性构建顺式糖苷键和包含C2-脱氧糖的键那么普遍，但许多不同的合成过程特定溶剂/添加剂的使用、远程保护基团参与、供体和受体的预组织以及其他方法使得立体控制形成越来越多的顺式糖苷键成为可能。
图1：A.作为α或β-糖苷键的立体特异性形成。B.环状氧鎓离子中间体的形成导致β-糖苷键的形成。
02
保护基团的操作
碳水化合物具有丰富的官能团。这使聚糖合成复杂化，并且需要投入大量的时间和精力来开发合适的保护基团方案，该方案允许随意保护和去保护单个官能团。碳水化合物官能团包括羟基、胺和羧酸盐，区分这些官能团相对容易。羟基（碳水化合物中最丰富的官能团）的选择性定位有些复杂。伯羟基和异头羟基相对容易操作，前者是空间原因，后者是因为它们是半缩醛或半缩酮的一部分。仲羟基的特殊获取需要专门利用其构型（顺式羟基与反式羟基，赤道羟基与轴向羟基）和相对反应性（即利用空间或电子差异）的化学。从S-甲苯基吡喃葡萄糖开始的代表性保护基方案（S-甲苯基既是异头羟基的掩蔽基，也是糖基化方案中的离去基）如图2所示。在第一步中，将所有羟基转化为相应的三甲基甲硅烷基醚，使极性碳水化合物可溶于有机溶剂。接下来，在一系列互补官能团操作中，O-2（A）、O-4（B）或O-6（C）被选择性释放。在所有情况下，第一步包括4,6-O-亚苄基物质的产生。O-3的还原性苄基化和随后O-2的苯甲酰化以及亚苄基向O-4-苄基的还原性开放可传递葡萄糖组成部分C。亚苄基向O-6-苄基的选择性还原性开放可递送B，而保持亚苄基完整并去除任何剩余的甲硅烷基保护基则递送葡萄糖苷A。
图2：保护基团的操作，可以在一次性程序中进行，对一系列吡喃糖衍生的聚糖组装构建块。
具有代表性的溶液相化学聚糖合成
在合成铜绿假单胞菌胞外多糖的假定重复单元的片段时（图3），保护基团模式和糖基化策略之间的相互作用变得明显。由苯基亚硫酰基哌啶（BSP）和三氟甲酸酐（Tf2O）促进的4,6-O-亚苄基保护的硫代甘露糖苷1与正交保护的岩藻糖苷2的糖基化得到二糖3。β-甘露糖苷键的立体选择性产生是在亚苄基部分稳定的中间体异头α-三氟甲磺酸酯的SN2置换之后进行的。
图3：铜绿假单胞菌衍生的十糖10的溶液相合成。
氧化去除萘基（Nap）保护基并用甘露糖苷4进行糖基化得到三糖5。还原性岩藻糖苷上的异头烯丙基（All）被去除并转化为糖基三氯乙酰亚胺酯，其与正交保护的葡萄糖苷6的3-羟基缩合，得到四糖7。岩藻糖构建体2中的2-O-苯甲酰基（Bz）参与基团确保了1,2-反式构型。四糖7的细化导致了充分保护的十糖10，并说明了对两个不同保护的构建体1和4的需要。1中的苄基（Bn）保护性基团用作在合成的最后阶段被去除的永久性保护基团。相反，在合成过程中，4中的叔丁基二甲基甲硅烷基（TBS）基团可以被选择性地去除。甘露糖残基中的2-羟基被释放，并用构建体8进行1,2-反式（α）甘露糖基化。9的整体脱保护作用分两步进行：碱处理以去除酰基保护基团，然后通过催化加氢同时去除苄基、萘基和亚苄基。还原性末端间隔区的叠氮化物转化为胺，用于免疫研究中新糖蛋白合成，或产生聚糖阵列。
03
代表性的自动化聚糖组装
自动化固相合成对肽/蛋白质和核酸的化学和生物学产生了巨大影响。合成化学的这一发展为生物学家提供了寡肽和寡核苷酸，并促进了生物聚合物结构和功能的研究。同样，用于聚糖合成的通用自动化（固相）方法的可用性大大加快了生物研究获得均质聚糖的速度。由于低聚糖合成比寡肽和核苷酸的组装复杂得多，聚糖组装的自动化程序进展较慢，但自动化合成仪器现在已在商业上可用。自动化聚糖组装（AGA）的先决条件是完全控制新形成的糖苷键的立体化学。AGA基于具有正交保护基团和连接基团的单糖构建模块。AGA的重要附加价值是能够快速生成相关但不同的聚糖文库，以及能够制备其他方法难以获得的多糖大小。
100-mer聚甘露糖苷的合成首先要在自动合成仪器的反应容器中放置一种配备有光裂解连接体11的聚苯乙烯Merrifield树脂。使用四步循环将甘露糖硫代糖苷构建体12用于AGA（图4A）。每种单体的掺入依赖于酸性洗涤步骤，以防止被任何剩余的碱淬火，然后使用5~6.5相当的量的构建体12进行偶联步骤。接下来，封端步骤防止任何未反应的亲核试剂参与随后的偶联以产生难以从所需产物中分离的 (n-1)-多糖。去除临时Fmoc保护基团暴露亲核试剂用于随后的偶联步骤。在188小时内自动执行100个偶联循环，并在从树脂中光裂解和正相HPLC纯化后产生100-mer α-(1-6) 聚甘露糖苷13（总产率8%）。通过用甲醇钠处理裂解所有酯保护基，然后在压力下钯催化氢解以释放所有苄基醚保护基团，在制备反相HPLC后产生100-mer聚甘露糖苷14。
图4：A.自动化聚糖组装示意图。B.100-mer 聚甘露糖苷14的自动聚糖组装（AGA）。C.海藻酸十二糖的AGA。
由β-1,4-甘露糖醛酸组成的海藻酸十二聚体的合成值得注意，因为它需要重复组装顺式糖苷键。该合成利用了固定化的烯丙醇15。在催化量的三氟甲磺酸（TfOH）下与供体甘露糖醛酸酯16反应产生固定化单糖17。通过用单乙酸肼（H2N-NH2）处理来去除O-4处的乙酰丙酸酰基（Lev）基团，之后将偶联脱保护序列重复所需次数。聚糖组装完成后，通过交叉复分解从固体支持物中去除完全保护的寡糖，随后通过强碱和氢解处理去除所有保护基团。
通过AGA制备的多糖的嵌段偶联可以获得更复杂的多糖。两个多糖嵌段，由AGA从甘露糖构建嵌段12制备的线性30-mer α-(1-6) 聚甘露糖苷21和由AGA使用12和不同保护的甘露糖结构嵌段22制备的支链31-mer聚甘露糖苷23，在31+30+30+30+30偶联中结合，产生支链151-mer 24，其被脱保护以支持25（图5）。
图5：通过自动聚糖组装（AGA）制备的聚甘露糖苷的嵌段偶联合成115-mer 聚甘露糖苷。
计算机辅助聚糖组装
硫代糖苷供体的相对反应性值（RRVs，一个指示糖苷基供体反应性的数字）的数据库已用于一次性设计糖基化序列。几种硫代糖苷结合在一起，可以实现其中一个构建体相对于其他构建体的选择性活化。Optimer计算机程序有助于选择构建体的组合，这些构建体配备了一组适当的保护组来调节反应性。图6显示了使用Optimer方法的肿瘤相关N3抗原八糖的一次性组装。设计并合成三个构建体：岩藻糖基供体26（RRV=7.2×104）、乳糖胺供体27（RRV=41）和乳糖构建块28（RRV=0）。后者通过化学选择性糖基化利用RRVs制备。BSP/Tf2O介导的缩合反应中前两个构建体的组合得到三糖硫代糖苷。向反应容器中加入乳糖28和NIS/TfOH以促进随后的双糖基化得到八糖29。脱保护后，以11%的产率获得间隔区功能化的单糖30。
图6：一次性合成单糖抗原32。
原文：
Seeberger PH, Overkleeft HS. Chemical Synthesis of Glycans and Glycoconjugates. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2022.
